Immunoassay

Details
Last Updated: Monday, 28 February 2022 12:51
Published: Saturday, 01 June 2019 23:19

Tillämpning
Tekniska principer
Utvärdering av resultat
Kvalitetskritiska faktorer
För- och nackdelar
Att tänka på
Referenser

Tillämpning

Immunoassay går ut på att så kallade biomarkörer, i form av antikroppar med specifika bindningsegenskaper för det analyserade ämnet, tillsätts provet. Det finns även en mängd andra testkit som inte bygger på antikroppar, det vill säga som inte är baserade på immunoassay, vilka därför inte redovisas i detta kapitel.

Immunoassay kan användas för att påvisa och semikvantifiera organiska föreningar som alifater, monoaromater, PCB, PAH, TNT och klorerade och icke-klorerade bekämpningsmedel i prover på jord, sediment, ytvatten och grundvatten. Även vissa metaller som t.ex. kvicksilver och arsenik kan bestämmas med immunoassay. (1)(2)

Exempel på ämnen/föreningar som kan påvisas och kvantifieras med godkända metoder enligt det amerikanska naturvårdsverket (USEPA) baserade på immunoassay redovisas i Tabell 1 nedan. 

Tabell 1.  Typiska användningsområden för immunoassay med godkända metoder enligt USEPA:

tabell immunassey

Immunoassay kan t.ex. användas för att under pågående efterbehandling fastställa om halten av ett urval ämnen/föreningar över- eller underskrider uppsatta åtgärdsmål/riktvärden. Immunoassay kan också används i samband med undersökningsarbeten som komplement till konventionella provtagnings- och analysinsatser, till exempel för att identifiera förorenade delområden där provuttag för efterföljande laboratorieanalyser bör genomföras.

Vattenprover kan i regel analyseras direkt med immunoassays. Jord- och sedimentprover måste dock extraheras innan analys kan ske. Detta görs med fördel i ett fältlaboratorium. Vid extraktionsförfarandet vägs några gram av ett jord- eller sedimentprov upp i ett provkärl. Mellan 10 - 20 ml extraktionsmedel, vanligen metanol, tillsätts för att extrahera aktuella föroreningar från provet. Blandningen skakas sedan i en till två minuter. I vissa kit finns stålkulor i provkärlet för att jordpartiklarna ska finfördelas i lösningen genom skrubbning. Lösningen får sedimentera under några minuter varefter den filtreras till en vial. Därefter späds lösningen med buffertlösning enligt instruktioner från tillverkaren varefter färgförändringen mäts med spektrofotometer. (1)(2) Extraktionsmetoden är relativt mild och ämnen som binder hårt till partiklar, t.ex. dioxin och PCB kan vara svåra att extrahera och därmed även kvantifiera. För fördjupad beskrivning om hur metoden används se https://clu-in.org/characterization/technologies/immunoassay.cfm.

 

Tekniska principer

Immunoassay bygger på egenskapen hos vissa antikroppar att bindas selektivt till en viss grupp av ämnen/föreningar. Bindningen är ämnesspecifik och fungerar ungefär som ”en nyckel i ett lås”, d.v.s. antikropparna ”söker upp” det specifika ämnet/ämnesgruppen och binder enbart till detta och inte till andra ämnen/ämnesgrupper. Därefter tillsätts enzymer till provet vilket ger upphov till en mätbar signal genom att påverka biomarkören hos den tillsatta antikroppen. Olika typer av signaler kan avges från provet beroende på typ av markör. Signalen består vanligen av fluorescens, synligt ljus eller en färgförändring i det undersökta provet och styrkan på signalen ger en indikation på halten av ämnet som antikroppen binder till. I figur 1 visas en skiss på hur en antikropp binder till ett ämne.

immunassay anti

Figur 1. Förorening exemplifieras som grön cirkel med en antikropp som bundit till ytan och vid tillsats av biomarkör kan avge en specifik signal.  

Detektionsgränser för analyser med immunoassay sträcker sig från ppm-nivå (mg/kg eller mg/l) ned till ppt-nivå (ng/kg eller ng/l). Detektionsgränserna i enskilda fall beror av detektionsmetod, provmatris och vilka ämnen eller ämnesgrupper som analyseras. Generellt är detektionsgränserna högre för jord- och sedimentprover jämfört med vattenprover på grund av att jord- och sedimentproverna först måste extraheras. 

Det finns flera olika analyskit för immunoassays. Gemensamt för de kommersiellt tillgängliga testkiten är att de innehåller de nödvändiga beståndsdelarna i form av provkärl, enzym- och färg-lösningar och kalibreringsstandarder. En manual för respektive kit medföljer. (1)(2)(3)(4)

 

Utvärdering av resultat

Koncentrationsbestämningar med hjälp av en spektrofotometer måste alltid göras utifrån en standardkurva baserad på kalibreringsstandarder. Standardkurvan erhålls genom att avläsa absorbansen i lösningar med känd koncentration och överföra dessa värden till en graf (=standardkurvan). Absorbansen i det aktuella provet jämförs sedan mot standardkurvan. Vid analysförfarandet måste det alltid finnas med ett blankprov som genomgår samma provbearbetning som övriga prover för att utesluta korskontaminering mellan proverna. (1)(2)

 

Kvalitetskritiska faktorer

Vid analys av både fasta prover och vattenprover bör eventuella interferenser mellan liknande ämnen/ämnesgrupper i provet beaktas vid tolkningen av resultaten. Detta utförs genom att kalibrera uppmätta resultat mot resultat från ackrediterade analyser på ett laboratorium. Som exempel på interferens kan nämnas att kit framtagna för en PAH (med en specifik sammansättning av ringarna) ändå kan resultera att antikropparna binder svagt till andra PAH (som har en annan ringform) och kan göra att aktuell PAH överskattas, alternativt att den totala summan underskattas. (1)(2)

Vid extraktion av jord- och sedimentprover är det viktigt att använda rätt typ av extraktionsmedel för de aktuella föroreningarna, normalt ingår de i provtagningsutrustningen, och att beakta provmatrisens inverkan på föroreningarnas extraherbarhet. Exempelvis är det svårare att uppnå en hög extraktionseffektivitet i finpartikulära jordarter och i sediment än i sand- och grusjordar eftersom extraktionsmedlet har svårare att komma i kontakt med specifika partikelytor i finkorniga material, något som kan motverkas med kit med stålkulor för finfördelning. För organiska föroreningar påverkas extraktionseffektiviteten även av halten av naturligt organiskt kol. Även ämnenas affinitet för extraktionsmedlet påverkar, till exempel finns det begränsad möjlighet att extrahera samtligt PCB och PAH i jord (pga. att de binder hårt i jord) med förhållandevis milda lösningsmedel, som till exempel metanol.

 

För- och nackdelar 

Fördelar

  • Immunoassay-kit är relativt enkla att använda och lätta att bära med sig i fält.
  • Analyskostnaderna per prov är låga och ett stort antal olika föroreningstyper kan analyseras på kort tid.
  • Detektionsgränserna är beträffande ett flertal ämnen/ämnesgrupper relativt låga, till exempel för pesticider och PCB, i vissa fall jämförbara med detektionsgränser för motsvarande ämnen/ämnesgrupper vid standardiserade laboratorieanalyser.

Nackdelar

  • De ingående komponenterna i ett immunoassaykit är ofta ljuskänsliga, vilket innebär att analys inte kan genomföras i direkt solljus. Man behöver därför ha tillgång till en arbetsbod eller dylikt.
  • Det är inte heller önskvärt att genomföra analyser vid låga temperaturer eftersom enzymatiska reaktioner ofta fördröjs eller helt uteblir vid låg temperatur.
  • Interferenser mellan liknande ämnen/ämnesgrupper i provet kan minska analyssäkerheten eller orsaka falska positiva svar.
  • Immunoassay ger i allmänhet inte en exakt haltangivelse. Istället anges ett haltintervall inom vilket ett visst ämne eller ämnesgrupp föreligger.

 

Att tänka på inför Immunoassay

Inför en undersökning baserad på immunoassay är det viktigt att ställa sig följande frågor:

  • Vilka ämnen ska undersökas och vid vilka halter förväntas dessa föreligga?
  • Vilka osäkerhetsfaktorer föreligger och hur ska dessa hanteras? T.ex. kan det vara svårt att extrahera vissa ämnen/ämnesgrupper från ler- och siltjordar vilket bör beaktas vid tolkning/utvärdering av analysresultat.

 

Referenser/lästips

(1) Bergqvist, C, Helldén, J, Pirard, E och von Heijne P. (2017): Dynamiska miljöundersökningsmetoder för förorenade områden. En översikt och metodbeskrivning. Svenska Geotekniska Föreningen, nr 3-2017.
(2) USEPA. (2016a). The Contaminated Site Clean-Up Information (CLU-IN) Web Site. https://clu-in.org
(3) USEPA. (2016b). Triad Resource Center Web Site. www.triadcentral.org.
(4) USEPA. (2016c). United States Environmental Protection Agency Web Site. https://www.epa.gov/superfund/cleanup-optimization-superfund-sites. Hämtat från https://www.epa.gov/superfund/cleanup-optimizationsuperfund-sites